Staphylococci isolated from caprine and ovine mastitic milk: virulence factors and antimicrobial and antibiofilm effectiveness of propolis extracts

Abstract

Small ruminant mastitis is a major problem for milk producers and consumers causing economic losses and public health threats. This disease is mainly caused by Staphylococcus. The aim of this work was to study propolis for the control of small ruminant mastitis as an alternative to conventional antimicrobials. A total of 137 Staphylococcus belonging to 13 species, recovered from the milk of goats and sheep, were studied. Phenotypic biofilm production and antimicrobial susceptibility were examined. Genes coding for virulence factors were studied: coa, nuc, bap, icaA, icaD, blaZ, mecA, mecC, tetK and tetM. Propolis is a resinous substance produced by honeybees which has been used as a natural medicine for its antiseptic, antimicrobial, antioxidant, anti-inflammatory, and other immunomodulatory properties. Propolis ethanol extracts (PEE) were prepared using different propolis from both Brazil and Portugal. These PEE were chemically characterised and their antimicrobial and antibiofilm activities were assessed. Results showed an association between biofilm production and mastitis inflammatory response. Beta-lactam resistance was mainly detected and an association between animal species and resistance to some antibiotics was found. All isolates were susceptible to gentamicin and cefazolin. The nuc gene was detected in several coagulase negative staphylococci, highlighting its inadequacy for S. aureus identification. Regarding the use of propolis for mastitis control, most PEE showed inhibitory activity against all staphylococci isolates. Furthermore, PEE are bactericidal, which is a very important feature of propolis. Moreover, PEE are effective in inhibiting biofilm formation and in destroying the formed biofilm. The presence of individual phenolics enhanced bactericidal activity, whereas triterpenes negatively influenced both antimicrobial and antibiofilm activity. The results of the present study suggest that propolis should be considered for the control of small ruminant mastitis caused by staphylococci. Nevertheless, future studies are needed to identify the individual propolis compounds exhibiting both antimicrobial and antibiofilm activity; Resumo: A mastite dos pequenos ruminantes é um problema para os produtores e consumidores de leite, causando perdas económicas e ameaças à saúde pública. Esta doença é principalmente causada por Staphylococcus. O objetivo deste trabalho foi estudar a própolis para o controlo da mastite dos pequenos ruminantes como alternativa aos antimicrobianos. Estudaram-se 137 Staphylococcus de 13 espécies, isolados do leite de cabras e ovelhas. Avaliou-se a produção de biofilme e a suscetibilidade aos antimicrobianos. Analisaram-se alguns genes de virulência: coa, nuc, bap, icaA, icaD, blaZ, mecA, mecC, tetK e tetM. A própolis é uma substância resinosa, produzida por abelhas, utilizada como medicamento natural pelas suas propriedades antissépticas, antimicrobianas, antioxidantes, anti-inflamatórias, entre outras. Os extratos etanólicos de própolis (PEE) foram preparados com diferentes própolis do Brasil e de Portugal. Estes PEE foram caraterizados quimicamente e as suas atividades antimicrobiana e antibiofilme avaliadas. Existe uma associação entre a produção de biofilme e a resposta inflamatória à mastite. A resistência aos beta-lactâmicos foi a mais frequente e encontrou-se uma associação entre espécie animal e resistência a alguns antimicrobianos. Todos os isolados foram suscetíveis à gentamicina e à cefazolina. O gene nuc foi detetado em estafilococos coagulase-negativos, mostrando-se inadequado para a identificação de S. aureus. Quanto ao uso de própolis no controlo da mastite, a maioria dos PEE mostrou atividade inibitória contra todos os estafilococos. Além disso, os PEE são bactericidas, uma importante característica do própolis. Adicionalmente, os PEE inibem eficazmente a formação e destroem o biofilme formado. A presença de determinados fenóis aumenta a atividade bactericida, enquanto que os triterpenos influenciam negativamente as atividades antimicrobiana e antibiofilme. Os resultados obtidos sugerem que a própolis seja usada no controlo da mastite de pequenos ruminantes causada por estafilococos. No entanto, são necessários mais estudos para identificar individualmente os compostos do própolis com atividade antimicrobiana e antibiofilme.