Targeted gene editing in Neospora caninum using CRISPR/Cas9

Abstract

Apicomplexa are amongst the most prevalent and morbidity-causing pathogen agents worldwide, representing serious challenges to animal and public health. Neospora caninum and Besnoitia besnoiti are causing agents of neosporosis and besnoitiosis. Until today, there are no effective treatment options against these parasitosis. Therefore, it is urgent to invest in the development of methods for diagnosis, prevention, control, and treatment against these protozoan pathogens. The present dissertation is divided in two parts. The first part summarizes three assays on drug development, testing the in vitro efficacy of selected endochin-like quinolones (ELQs) against B. besnoiti and N. caninum tachyzoites on a 3-day proliferation inhibition assay, long-term experiment with the duration of 20 days, and ultrastructural changes induced by ELQs were evaluated in N. caninum. The second part of the report consists of a monography reviewing the CRISPR/Cas9 gene editing technology applied to a targeted sag1 gene knock-out in N. caninum assay; Resumo: Os parasitas do filo Apicomplexa estão entre os agentes patogénicos causadores de morbilidade mais prevalentes no mundo, representando sérios desafios para a saúde pública e animal. Neospora caninum e Besnoitia besnoiti são agentes etiológicos da neosporose e besnoitiose. Até hoje, não existem opções de tratamento e prevenção disponíveis para estas parasitoses, tornando-se urgente investir no desenvolvimento de métodos para o diagnóstico, prevenção e tratamento destes protozoários. A presente dissertação está dividido em duas partes. A primeira parte relativa a três ensaios focados no desenvolvimento de medicamentos, testa a eficácia in vitro de endoquinas tipo quinolonas contra taquizoítos de B. besnoiti e N. caninum num ensaio inibiçãoproliferação de três dias, numa experiência de tratamento de longo-curso e através de microscopia de transmissão de eletrões para avaliar alterações ultraestruturais. A segunda parte consiste numa monografia sobre a tecnologia de edição genómica CRISPR/Cas9 aplicada ao knock-out do gene sag1 em N. caninum.