Síntese de novos fluoróforos, solúveis em água e reativos ao grupo amino, para marcação de biomoléculas: aplicação ao património cultural

Abstract

A preservação do Património Cultural é crucial para toda a sociedade em geral, sendo essencial o desenvolvimento de novas estratégias e metodologias de microanálise sensíveis, que possibilitem o planeamento de ações eficazes de remediação e mitigação. A marcação fluorescente de biomoléculas é atualmente uma das metodologias mais usadas para fins bioanalíticos e, por essa razão, a técnica de Hibridação in situ Fluorescente (FISH) é considerada uma ferramenta essencial de análise no campo do Património Cultural. Neste trabalho, pretendeu-se desenvolver uma estratégia sintética simples e eficiente para produzir novos marcadores fluorescentes, solúveis em água, de baixo custo e reativos ao grupo amino, para marcação de biomoléculas. A referida metodologia permitiu a obtenção de nove novos marcadores fluorescentes, com elevada sensibilidade, para a identificação e deteção de biomoléculas no contexto de microamostras do Património Cultural. A síntese de derivados 2-substituídos da 7-dietilamino-4-metilcoumarina com a inclusão de um grupo 4-estirilo, com o objetivo de expandir a deslocalização eletrónica através de um sistema do tipo Doador de eletrões - ponte p - Aceitador de eletrões, permitiu a obtenção de seis novos promissores marcadores fluorescentes. Utilizando uma estratégia eficiente e económica, e com um custo inferior aos derivados da 7-dietilamino-4-metilcoumarina, foram sintetizados a partir do 4-dietilaminobenzaldeído três novos marcadores fluorescentes com excelentes propriedades fotofísicas. As sondas preparadas com os novos marcadores fluorescentes, derivados da 7-dietilamino-4-metilcoumarina e do 4-dietilaminobenzaldeído, apresentaram elevada capacidade para a marcação das células de S. cerevisiae e de Bacillus sp., com valores percentuais de células fluorescentes muito semelhantes aos das células hibridadas com a sonda comercial EUK516-Cy3. Os resultados obtidos através da técnica FISH são de difícil correlação direta com as propriedades fotofísicas dos respetivos marcadores fluorescentes, ou seja, em última análise, o desenvolvimento de sondas fluorescentes depende, em grande medida, de tentativa e erro ou de descoberta fortuita. Synthesis of new fluorescent water-soluble amine-reactive reagents for biomolecules labeling: application to cultural heritage - Abstract: Preserving Cultural Heritage is crucial for society. Developing innovative strategies and sensitive microanalysis methodologies is essential to effectively plan remediation and mitigation actions. Fluorescent labeling of biomolecules is currently one of the most widely used methodologies for bioanalytical purposes and, for this reason, the Fluorescent in situ Hybridization (FISH) technique is considered an essential analytical tool in the field of Cultural Heritage. The objective of this study was to develop a simple and efficient synthetic strategy to produce new, water-soluble, low-cost, amino group-reactive fluorescent markers for labeling biomolecules. This approach has yielded nine new fluorescent markers that exhibit high sensitivity in identifying and detecting biomolecules in the context of cultural heritage micro-samples. The synthesis of 2-substituted derivatives of 7-diethylamino-4-methylcoumarin incorporating a 4-styryl group aimed to enhance electronic delocalization via an electron donor - p bridge - electron acceptor system, yielding six new promising fluorescent markers. Using an efficient and economical strategy, and at a lower cost than derivatives of 7-diethylamino-4-methylcoumarin, three new fluorescent markers with excellent photophysical properties were synthesized from 4-diethyl-aminobenzaldehyde. The probes prepared with the new fluorescent markers, derived from 7-diethylamino- 4-methylcoumarin and 4-diethylaminobenzaldehyde, showed high capability for marking S. cerevisiae and Bacillus sp. cells, with percentage values of fluorescent cells very similar to those of cells hybridized with the commercial probe EUK516-Cy3. The results obtained through the FISH technique are difficult to correlate directly with the photophysical properties of the respective fluorescent markers, meaning that, ultimately, the development of fluorescent probes depends largely on trial and error or serendipitous discovery.